Marcadores de células madre mesenquimales

Para ampliar la información sobre las células madre mesenquimales del post anterior, en este hablaremos un poco de los marcadores de superficie.

Actualmente no hay marcadores específicos para una determinación exacta de células madre mesenquimales (CMM). Los principales criterios para su identificación son los siguientes:

•  Capacidad de adherencia al plástico en condiciones de cultivo celular estándar.
•  Su capacidad de proliferación prolongada en cultivo manteniendo sus características. 
•   Expresión de marcadores de membrana celular característicos de células Madre
•  Capacidad de diferenciación in vitro en células de origen mesodérmico (condrocitos, adipocitos y osteoblastos).

En cuanto a la expresión demarcadores de membrana, la población debe expresar, al menos CD105, CD73 y CD90, medidos mediante citometria de flujo. De igual manera deben carecer de la expresión o expresar menos de un 2% de positividad para los antígenos CD34, CD45 característicos de células madre hematopoyéticas.

Además, muchos autores proponen otros marcadores de células madre mesenquimales que pueden encontrarse en las células CD105, CD90 y CD73 positivas como CD29, CD106, CD166, CD44 o CD271 y que dependen mucho de la zona de extracción de las células madre mesenquimales.

CD 105 (endoglina)	Caracteristico de células progenitoras de adipocitos-condrocitos-osteocitos.
CD90 (Thy-1)	Células de tejido neuronal, placenta, y muchos tejidos conectivos.
CD73	Asociado a adherencia celular

Todos estos conocimientos hacen, que a la hora de estandarizar un protocolo de aislamiento de células madre mesenquimales sea imprescindible analizar la población obtenida por citometria de flujo un mínimo de veces suficiente que permita asegurar que las células obtenidas a través de nuestro protocolo sean CMM.

En nuestro caso, además de los estudios de diferenciación descritos anteriormente, las poblaciones obtenidas con el protocolo más exitoso se analizaron mediante citometria de flujo y se estudiaron los siguientes marcadores de superficie.

MARCADORES	RESULTADOS
CD 90	Positivo (99%)
CD73	Positivo (80-95%)
CD105	Positivo (98%)
CD29	Positivo (95%)
CD117	Negativo
CD271	Negativo
CD44	Positivo (99%)
CD106	Negativo
CD166	Positivo (75%)
CD34	Negativo
CD45	Negativo
SSEA-1	Negativo
Antifibroblastic	Negativo

 Estos resultados, repetidos en todas las extracciones de celulas madre, nos ha llevado a garantizar que nuestra población obtenida mediante nuestro protocolo está formada por células madre mesenquimales, y no encontramos en ella otras poblaciones celulares no deseadas como macrófagos, fibroblastos o celulas madre hematopoyéticas.

¿Y porque tiene esto tanta importancia?

Por un lado, porque nuestros tratamientos solamente tendrán éxito si la población que usamos es de, al menos, 95% de celulas madre, asegurando que, cuando calculamos la dosis necesaria para un tratamiento (un millon de celulas, dos, veinte, el numero que haga falta) , al aislar y hacer un recuento de esas celulas y utilizarlas no estamos administrando un número de celulas menor al que necesitamos.

Por otro lado, porque algunas de las celulas que queremos evitar, como los fibroblastos, o los macrofagos, podrían tener ciertos efectos contrarios indeseados en algunas patologías.

En resumen, siempre que utiliceis células madre mesenquimales, es importante que estos procedimiento hayan sido llevados a cabo y que la población con la que se trate a los animales sea la más pura posible.

Álgunas imágenes de Células Madre

Como os comentaba el otro día, las células madre se caracterizan por ciertas cosas que no hacen o no tienen el resto de células.
Por un lado, poseen una seríe de marcadores en su membrana, que, aunque aun no están completamente definidos, las diferencia de otras celulas indeseables ( o sin sus beneficios) como los fibroblastos o los macrófagos. De todos estos marcadores os hablaré en otra ocasión.
Ahora mismo vamos a centrarnos en lo que por encima de todo caracteriza a las células madre: Su capacidad para convertirse en células adultas de diferentes tejidos, como la grasa, el hueso o el cartílago.
En general, cuado se quiere comprobar que en el proceso de obtención lo que, efectivamente, hemos obtenido, son células madre, los estudios de diferenciación validados son los que hacen diferenciarse a las células madre mesenquimales a celulas de grasa (adipocitos), de hueso (osteocitos) y de cartilago (condrocitos).
Esto se hace cultivando esta celulas en un ambiente y con unos factores especiales para que se conviertan en esta celulas. Si son células madre, se diferenciarán a los tres tejidos, si no, puede que a uno, o a ninguno.

¿Y cual es el método por el que se comprueba si se han diferenciado?

Lo cierto es que un ojo experto lo puede ver a simple vista bajo microscopio, sobre todo si se han convertido en celulas de grasa, ya que esta celulas almacenan en su interior las gotas de lípidos, como si fueran gotas de aceite, y se ven realmente curiosas. Las de hueso también son sencillas, ya que en condiciones normales, y para darle al hueso su robustez y dureza, las células de hueso producen calcio y fosfato, y cuando están en cultivo, estos depositos se ven por encima de las células.
En el caso del cartílago es más complicado, y no se ve a simple vista, por lo que siempre hay que hacer tinciones especiales de componentes especificos de estas células para comprobarlo. En cualquier caso aunque las otras se vean a simple vista, también se realizan siempre tinciones, concretamente la denominada Oil Red, que tiñe de un rojo intenso las gotas de grasa ( y en realidad cualquier lipido de la célula, por lo que cualquier celula de nuestro cuerpo se teñiría ligeramente ya que todas tienen lipidos en su membrana).
La que se realiza para el hueso, se hace para poner de manifiesto los depositos de calcio y fosfato de un tono desde anaranjado cuando es ligero a granate cuando hay mucho y se denomina Rojo Alizarina. La verdad es que son nombres bastante artísticos para cosas tan tecnicas, no os parece?
Para que lo veais, os dejo unas imágenes de nuestras células, en primer lugar del Rojo Alizarina, con unas celulas que no se han estimulado y se denominan Grupo Control, y las estimuladas para diferenciarse a hueso.
Obviamente, al teñir solamente los depositos, en la primera foto apenas si vemos nada. Lo que se intuye al fondo es el contorno de las células. Sin embargo, en la foto de la derecha podemos ver unos punteados rojizos que se corresponden con los depositos de calcio y fósforo.

Sin embargo, en este otro caso de estimulación para convertirlas en celulas de grasa, en el que lo que queremos ver son las células si que podemos ver como en la imagen de la izquierda, que se corresponde al control,  se ven nuestras céluas con unos pequeños puntos rojos, que en general son los lípidos propios de la composición de cualquier célula. En la segunda imagen, sin embargo, vemos grandes gotas rojas que llenan la mayorías de las células, porque éstas se han convertido en adipocitos.

Estas imágenes son fotografías tomadas a nuestras propias células en cultivo, para la validación de nuestro protocolo.

Espero que os guste el post, en el siguiente, hablaré un poco de los marcadores de membrana de las células.